□ 張 帆 陶 濤 王水明 文/圖
“埃博拉病毒檢測技術(shù)儲備研究”建立的針對埃博拉病毒及其5種亞型的檢測方法，為我國埃博拉病毒防控提供了第一手資料及技術(shù)手段，這將有助于我國對出入境貿(mào)易商品中攜帶EBV進(jìn)行科學(xué)評價，對進(jìn)出境人員、易感動物進(jìn)出境的EBV預(yù)警防控提供必要的檢測技術(shù)儲備。
檢測人員確認(rèn)PCR是首選檢測技術(shù)
實驗人員對檢測結(jié)果進(jìn)行照相分析
技術(shù)人員制備被檢樣品
江蘇南京檢驗檢疫局主持的江蘇檢驗檢疫局科研項目“埃博拉病毒檢測技術(shù)儲備研究”近日順利通過鑒定。鑒定會上，鑒定委員會聽取了課題組的研究工作匯報，審閱相關(guān)材料并進(jìn)行了質(zhì)詢，經(jīng)評議后一致認(rèn)為，課題組建立的針對埃博拉病毒及其5種亞型的檢測方法，具有良好的敏感性、穩(wěn)定性和重復(fù)性，對外來病防控和出入境動物產(chǎn)品檢驗檢疫具有重要意義，應(yīng)用前景廣闊，其成果達(dá)到國際先進(jìn)水平。
技術(shù)儲備 刻不容緩
埃博拉出血熱（Ebola haemorrhagic fever，EHF）是由埃博拉病毒（Ebola virus，EBV）引起的急性多器官溶血性疾病，屬于動物疫源性傳染病，人的病死率高達(dá)80％，是人類目前已知最為烈性的傳染病之一。由于該病最初是在蘇丹和扎伊爾間的埃博拉河流域發(fā)生，故稱為埃博拉血熱。
EBV通過干擾感染者機(jī)體凝血平衡，導(dǎo)致血管壁破壞或功能受損，血小板不能凝血，在2至21天內(nèi)出現(xiàn)出血性休克或器官衰竭。人感染EBV，主要表現(xiàn)為急性發(fā)熱、肌肉酸痛、頭痛、嘔吐；有出血趨勢和偶爾的休克癥狀，皮膚丘疹，胃腸道、呼吸道和器官瘀血、出血。由于體內(nèi)器官壞死、分解，病人不斷把壞死組織從口中嘔出，最后多因廣泛性內(nèi)出血、腦部受損等原因而死亡，世界衛(wèi)生組織已將EBV列為對人類危害最嚴(yán)重的病毒之一。
由于EBV危害程度分類為第一類，其病毒培養(yǎng)、動物感染等試驗必須在生物安全四級實驗室進(jìn)行，未經(jīng)培養(yǎng)的感染材料在生物安全三級實驗室，滅活材料在生物安全二級實驗室進(jìn)行。世界上僅有少數(shù)幾個國家的實驗室能開展埃博拉病毒的研究，主要集中在美國亞特蘭大的CDC。我國在埃博拉出血熱的檢測研究上還基本上屬于空白。
雖然目前我國境內(nèi)并沒有出現(xiàn)EHF的暴發(fā)，也不存在EBV。但是由于我國與外國貿(mào)易往來不斷增多，尤其是與非洲各國的交往比以往更為頻繁，EBV極有可能通過潛伏期病人或者隱性感染者以及感染的動物傳入我國。EHF若暴發(fā)將帶來難以估計的危害。加快EBV檢測技術(shù)的儲備，建立快速、準(zhǔn)確、特異的EBV實驗室檢測方法，對于口岸衛(wèi)生檢疫、動物及動物產(chǎn)品檢疫具有重要意義。檢測技術(shù)儲備，刻不容緩！
攻堅克難 創(chuàng)造領(lǐng)先
得到免疫性良好檢測抗原，避免使用全病毒所帶來的巨大風(fēng)險，首先要制備檢測抗原。在EBV核酸檢測時，一般選擇高度保守糖蛋白（GP）或核蛋白（NP）作為擴(kuò)增靶標(biāo)進(jìn)行設(shè)計引物或探針，課題組正是在EBV NP序列的5'端非編碼區(qū)的一段高度保守的序列進(jìn)行引物設(shè)計，實驗結(jié)果表明具有很高的特異性。由于我國現(xiàn)在還沒有感染EBV的臨床樣品，并嚴(yán)禁EBV的操作，課題組創(chuàng)新性地采用體外合成的辦法獲得目的基因，采用基因摻入法制備被檢樣品，并模擬樣品病毒滅活過程。
選擇適合我國情況的檢測方法。國外報道建立對EBV的多種檢測方法，如病毒分離、電鏡觀察、RT-PCR、Real-time PCR、PCR、ELISA、捕捉ELISA、血凝試驗、間接免疫熒光、Western blot等，從現(xiàn)場應(yīng)用結(jié)果來看，RT-PCR方法具有快速、敏感的優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合我國實際情況，PCR仍是最理想的首選檢測技術(shù)。
EBV與多種出血熱病毒有較近親緣性，尤其是馬爾堡病毒（Marburg Virus，MARV）同屬絲狀病毒屬。為了攻克這一難關(guān)，研究小組在EBV NP序列的5'端非編碼區(qū)的一段高度保守的序列進(jìn)行引物設(shè)計，采用特異性較強(qiáng)的套式PCR方法，在經(jīng)歷上百次失敗后，成功設(shè)計出合適的引物，進(jìn)而經(jīng)過反復(fù)摸索，優(yōu)化反應(yīng)條件，最終成功建立套式RT-PCR方法。該項方法不僅具有良好特異性，能區(qū)分EBV和MARV，而且具有高敏感性，可以檢測10pg的病毒RNA，將檢測敏感度提高了1000倍。
病毒亞型之間的同源性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于不同病毒之間，即使是國際上，目前也僅能對EBV的扎伊爾亞型、蘇丹亞型和本迪布焦亞型三種亞型進(jìn)行區(qū)分，尚無檢測萊斯頓亞型和科特迪瓦亞型方法的報道。研究組明知山有虎，偏向虎山行。在吸收國外成功經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，結(jié)合掌握的資料和前期的經(jīng)驗，采用Taqman Real-time RT-PCR技術(shù)，成功建立了分別檢測5種亞型的檢測方法，其中對萊斯頓亞型和科特迪瓦亞型的檢測方法為國際首創(chuàng)。這一研究成果，不僅填補(bǔ)了國內(nèi)外的研究空白，也具有重要的應(yīng)用價值，對于疾病的治療、病原的追溯、疾病的防控具有重要意義。
成果初現(xiàn) 走向應(yīng)用
課題組利用建立的檢測方法，對緬甸地區(qū)兩個縣，涉及3個科，5個屬的853只蝙蝠進(jìn)行了熒光定量EBV檢測，結(jié)果全部陰性；共收集全國15個省（市、區(qū)）豬臨床樣品920份，被采集臨床樣品的豬都表現(xiàn)出豬瘟、豬藍(lán)耳病、豬偽狂犬病、豬流感或豬流行性腹瀉病疑似癥狀，對這些樣品進(jìn)行了EBV RT-PCR檢測和萊斯頓亞型EBV檢測，結(jié)果全部為陰性。通過臨床樣品的檢測，一方面驗證了檢測方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性，另一方面，這是國內(nèi)首次針對EBV的流行病學(xué)調(diào)查，這為我國EBV的防控提供了第一手資料。
課題組在研究過程中，發(fā)表研究論文10篇，研究的“一種檢測埃博拉病毒的熒光定量PCR檢測方法及其引物和試劑盒”和“一步法檢測Z/S亞型埃博拉病毒的實時熒光定量RT-PCR方法及其試劑盒”申請國家發(fā)明專利，目前已成功受理。
該項目研究的5種亞型EBV的RT-PCR檢測方法、SYBR Green Ⅰ熒光定量RT-PCR檢測方法及單獨(dú)檢測每一基因亞型的EBV熒光定量RT-PCR檢測方法適用于大規(guī)模EBV流行病學(xué)調(diào)查，具有簡單、快速、敏感的優(yōu)點(diǎn)，將為進(jìn)出口動物檢疫，EBV易感動物監(jiān)測提供簡單、快捷的檢測工具。
鏈 接>>
（Ebola virus）又譯作伊波拉病毒，是一種能引起人類和靈長類動物產(chǎn)生埃博拉出血熱的烈性傳染病病毒。埃博拉病毒的名稱出自非洲扎伊爾的“埃博拉河”。
這種病毒來自“Filoviridae”族，與馬爾堡病毒類似。“埃博拉”病毒是一種十分罕見的病毒，這種病毒最早是于1967年在德國的馬爾堡首次發(fā)現(xiàn)的，但當(dāng)時并沒有引起人們的注意。1976年在蘇丹南部和扎伊爾即現(xiàn)在的剛果（金）的埃博拉河地區(qū)再次發(fā)現(xiàn)它的存在后，才引起醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注和重視，“埃博拉”由此而得名。在大約1500例確診的埃博拉案例中，死亡率高達(dá)88%。目前沒有有效的特效療法，也沒有埃博拉病毒的疫苗。
《中國國門時報》
